Guía de investigación de LL-37: catelicidina, inmunidad y uso en laboratorio

LL-37 es el único péptido antimicrobiano catelicidina humano: un péptido alfa-helicoidal de 37 aminoácidos escindido de la proteína precursora hCAP18, codificada por el gen CAMP . Se identificó a mediados de la década de 1990 por dos grupos de investigación suecos que trabajaban con neutrófilos humanos, y desde entonces se ha convertido en uno de los péptidos de defensa del huésped más estudiados en el laboratorio, no solo por su actividad antimicrobiana directa in vitro, sino también por una segunda identidad, igualmente documentada, como molécula de señalización que interactúa con receptores específicos de la superficie celular.

Esa doble identidad es la clave para leer la literatura sobre LL-37 con precisión. A concentraciones más altas en sistemas experimentales, LL-37 altera las membranas microbianas. A concentraciones más bajas en modelos celulares, atrae químicamente células inmunes, modula la señalización inflamatoria e influye en procesos como la angiogénesis y la reepitelización de heridas a través de vías mediadas por receptores. Las concentraciones, los sistemas modelo y las condiciones salinas afectan fuertemente qué comportamiento domina, y por eso esta guía separa la literatura de membranas de la literatura de receptores y reporta cada hallazgo dentro del modelo que lo produjo.

¿Qué es LL-37?

LL-37 es un péptido de 37 residuos que comienza con dos residuos de leucina; de ahí el nombre: LL por las leucinas iniciales, 37 por su longitud. No se sintetiza como una molécula independiente en el cuerpo. En su lugar, las células producen un precursor más grande, la proteína antimicrobiana catiónica humana 18 (hCAP18), que consta de un dominio catelina N-terminal conservado y la secuencia C-terminal de LL-37. La escisión proteolítica libera el péptido activo cuándo y dónde se necesita.

• Secuencia: LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES
• Longitud: 37 aminoácidos
• Gen: CAMP (péptido antimicrobiano catelicidina)
• Precursor: hCAP18, escindida extracelularmente, principalmente por la proteinasa 3 en los neutrófilos
• Fórmula molecular: C205H340N60O53
• Peso molecular: Aproximadamente 4,493.3 g/mol
• Número CAS: 154947-66-7
• Estructura: Alfa-hélice anfipática en entornos de tipo membrana; carga neta positiva (catiónica)

Los humanos tienen exactamente una catelicidina, lo que convierte a LL-37 en un sistema de investigación inusualmente limpio: a diferencia de las especies con grandes familias de catelicidinas, no hay un segundo parálogo humano que confunda la atribución. El ortólogo de ratón, CRAMP, es la herramienta correspondiente en los modelos murinos, y los investigadores deben mantener ambos distintos al comparar estudios entre especies.

Descubrimiento y procesamiento: de hCAP18 a LL-37

La catelicidina humana se identificó en 1995, cuando Agerberth y colegas clonaron un ADNc de médula ósea que codificaba un precursor de tipo catelina de 170 aminoácidos y su péptido C-terminal predicho, FALL-39: un péptido de 39 residuos, libre de cisteína, cuya forma sintética mostró actividad frente a bacterias de prueba in vitro, con el gen expresado principalmente en la médula ósea y el testículo. Trabajos posteriores de procesamiento establecieron que el péptido maduro recuperado de los neutrófilos humanos es el LL-37 de 37 residuos, escindido de ese mismo precursor, hCAP18:

Cita: Agerberth B, et al. "FALL-39, un posible péptido antibiótico humano, carece de cisteína y se expresa en la médula ósea y el testículo." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1995. [PubMed PMID: 7529412]

Los primeros trabajos estructurales explicaron entonces un comportamiento que recorre toda la literatura sobre LL-37: Johansson y colegas mostraron que LL-37 está desordenado en agua y adopta su conformación alfa-helicoidal en presencia de aniones y mediante oligomerización, y que esa helicidad se correlaciona con la actividad antibacteriana in vitro: la estructura del péptido, y por tanto su actividad, depende de su entorno:

Cita: Johansson J, et al. "Actividad antibacteriana dependiente de la conformación del péptido humano natural LL-37." Journal of Biological Chemistry. 1998. [PubMed PMID: 9452503]

Cómo el precursor se convierte en el péptido fue aclarado por Sørensen y colegas, quienes mostraron que hCAP18 se procesa extracelularmente tras la exocitosis de los neutrófilos: la proteinasa 3, liberada del mismo sistema de gránulos, fue la única responsable de la escisión entre las proteasas de gránulos azurófilos probadas. Esa temporalidad extracelular importa experimentalmente: significa que LL-37 aparece en los sitios de activación de neutrófilos en lugar de circular como un péptido libre en condiciones de reposo:

Cita: Sørensen OE, et al. "La catelicidina humana, hCAP-18, se procesa al péptido antimicrobiano LL-37 por escisión extracelular con proteinasa 3." Blood. 2001. [PubMed PMID: 11389039]

Mecanismo 1: interacción con membranas y actividad antimicrobiana directa

La secuencia de LL-37 se pliega en una alfa-hélice anfipática: una cara es rica en residuos con carga positiva (arginina y lisina) y la otra en residuos hidrofóbicos. Esa arquitectura explica su comportamiento con las membranas. La cara catiónica es atraída por las superficies de membrana microbiana con carga negativa; la cara hidrofóbica se inserta entonces en la bicapa lipídica, alterando la integridad de la membrana en sistemas modelo. Los estudios biofísicos en membranas artificiales y los ensayos microbiológicos frente a una amplia gama de bacterias — y, en trabajos in vitro publicados, ciertos hongos y virus con envoltura — forman el núcleo de esta literatura.

Dos cautelas experimentales la recorren. Primera, la actividad antimicrobiana de LL-37 in vitro depende fuertemente de la sal y del medio: las concentraciones fisiológicas de sal reducen la actividad frente a varios organismos en comparación con condiciones de ensayo de baja sal, de modo que las condiciones del ensayo forman parte de cualquier resultado. Segunda, la actividad en una placa de cultivo es una propiedad del sistema péptido–membrana bajo esas condiciones; no es, por sí misma, evidencia sobre el papel del péptido en un organismo completo, donde intervienen proteínas de unión, proteasas y compartimentación. La revisión estándar de esta primera identidad, y de la biología del péptido en general, sigue siendo la de Dürr y colegas:

Cita: Dürr UH, Sudheendra US, Ramamoorthy A. "LL-37, the Only Human Member of the Cathelicidin Family of Antimicrobial Peptides." Biochimica et Biophysica Acta. 2006. [PubMed PMID: 16716248]

Mecanismo 2: inmunomodulación mediada por receptores

La segunda literatura sobre LL-37 comenzó cuando los investigadores encontraron efectos a concentraciones muy por debajo de las necesarias para la alteración de membranas: efectos con la firma de la señalización por receptores más que de una acción de tipo detergente. El resultado emblemático fue la quimioatracción: De Yang y colegas mostraron que LL-37 atrae químicamente neutrófilos, monocitos y células T humanos a través del receptor 1 similar al receptor de péptidos formilados (FPRL1, ahora también denominado FPR2), un receptor acoplado a proteínas G definido:

Cita: De Yang, et al. "LL-37, la catelicidina derivada de los gránulos de neutrófilos y de las células epiteliales, utiliza el receptor 1 similar al receptor de péptidos formilados (FPRL1) como receptor para atraer químicamente neutrófilos, monocitos y células T de sangre periférica humana." Journal of Experimental Medicine. 2000. [PubMed PMID: 11015447]

Trabajos posteriores de biología celular añadieron otros sistemas de receptores, incluidas interacciones con P2X7 en monocitos y macrófagos y la transactivación del receptor del factor de crecimiento epidérmico en sistemas epiteliales, junto con una modulación reportada de la señalización de receptores tipo Toll y de la producción de citocinas en cultivos de células inmunes. Vandamme y colegas revisaron esta literatura de receptores de forma exhaustiva, y su resumen recoge el encuadre consensuado del campo: LL-37 es un péptido de defensa del huésped multifuncional cuyas actividades inmunomoduladoras se ejercen a través de dianas moleculares específicas, no solo a través de membranas:

Cita: Vandamme D, et al. "Un resumen exhaustivo de LL-37, el péptido catelicidina humano factótum." Cellular Immunology. 2012. [PubMed PMID: 23246832]

Aspectos destacados de la investigación publicada: modelos de reparación y vasculares

Reepitelización en modelos de heridas de piel humana

Heilborn y colegas examinaron LL-37 en heridas de piel humana usando un modelo ex vivo, y reportaron que el péptido estaba presente en el epitelio de la herida durante la cicatrización pero ausente en el epitelio de úlceras crónicas en sus muestras, y que bloquearlo o suplementarlo en el sistema modelo alteraba correspondientemente la reepitelización. El estudio es un resultado en un modelo de tejido humano: más fuerte que un hallazgo en línea celular, y aun así un modelo, no un ensayo de tratamiento:

Cita: Heilborn JD, et al. "El péptido antimicrobiano catelicidina LL-37 participa en la reepitelización de las heridas de la piel humana y está ausente en el epitelio de las úlceras crónicas." Journal of Investigative Dermatology. 2003. [PubMed PMID: 12603850]

Angiogénesis en sistemas modelo

La literatura de revisión también resume reportes de que LL-37 estimula la angiogénesis en sistemas modelo in vitro e in vivo, mediada por FPRL1 expresado en células endoteliales, extendiendo el mismo receptor identificado en el trabajo de quimioatracción a la biología vascular y respaldando el encuadre de las revisiones de LL-37 como un péptido con un segundo papel, impulsado por receptores, más allá de su actividad antimicrobiana. Los investigadores que rastreen esa afirmación específica deberían seguirla a través de las fuentes primarias recogidas en las revisiones de Dürr y Vandamme citadas arriba.

Junto con la literatura de membranas, estos estudios definen el panorama de trabajo que los investigadores usan realmente: un péptido, dos regímenes mecanicistas, con la concentración y el contexto decidiendo qué régimen observa un experimento. Ese panorama también conecta LL-37 con péptidos vecinos de la inmunidad innata estudiados por su señalización epitelial e inflamatoria, como el tema de nuestra guía de investigación de KPV, y con la revisión más amplia de nuestra guía sobre investigación de péptidos en inmunidad y antiinflamación.

Variables experimentales que modulan los resultados de LL-37

LL-37 es inusualmente sensible a las condiciones experimentales, y las revisiones citadas arriba vuelven repetidamente al mismo conjunto de variables. Los investigadores que diseñan o interpretan experimentos con LL-37 tienen en cuenta al menos cuatro de ellas.

• Fuerza iónica y composición del medio. La actividad antimicrobiana medida en tampones de baja sal puede caer sustancialmente a concentraciones fisiológicas de sal, y los componentes del suero se unen al péptido y cambian su concentración libre efectiva. Dos estudios que reportan valores de potencia diferentes a menudo están reportando condiciones de ensayo diferentes, en lugar de una biología diferente.
• Entorno proteolítico. LL-37 es en sí mismo un producto de proteasas, y también es un sustrato de proteasas: en entornos ricos en proteasas se procesa aún más en fragmentos más cortos, varios de los cuales conservan la actividad sobre membranas mientras pierden la actividad sobre receptores, o a la inversa. El perfil de fragmentos de una muestra es, por tanto, parte de su identidad.
• Régimen de concentración. La alteración de membranas y la señalización por receptores ocupan rangos de concentración diferentes en los sistemas modelo. Un experimento diseñado en torno a un régimen no puede usarse para confirmar ni refutar el otro, y el diseño de dosis–respuesta en modelos celulares debe indicar explícitamente qué régimen está sondeando, como una cuestión de diseño, no como una recomendación de uso.
• Manejo del péptido y agregación. Como una hélice anfipática y muy cargada, LL-37 se agrega y se adsorbe a las superficies con más facilidad que los péptidos cortos no estructurados. La preparación de las soluciones madre, los materiales de los recipientes y el historial de congelación–descongelación pueden desplazar la concentración realmente administrada a un ensayo, lo cual es una razón por la que las revisiones del campo insisten en la confirmación analítica del material en mano.

Estas variables también explican un patrón recurrente en la literatura: los hallazgos sobre LL-37 se replican con mayor limpieza cuando los artículos reportan las condiciones completas del ensayo, y las aparentes contradicciones entre grupos se resuelven con frecuencia en diferencias de sal, suero o composición de fragmentos una vez que los métodos se comparan en detalle.

Aplicaciones de investigación en el laboratorio

• Trabajo de ensayos antimicrobianos — sistemas in vitro definidos para la actividad de alteración de membranas, en los que la sal y la composición del medio se controlan y se reportan como parte del resultado.
• Biofísica de membranas — estudios de bicapas artificiales, liposomas y espectroscopia de la inserción de hélices anfipáticas, usando LL-37 como péptido helicoidal catiónico de referencia.
• Quimiotaxis y farmacología de receptores — ensayos de migración mediados por FPRL1/FPR2 en neutrófilos, monocitos y células T, siguiendo el diseño experimental de De Yang.
• Estudios de inmunomodulación — lecturas de señalización de citocinas y de receptores tipo Toll en cultivos de monocitos, macrófagos y células epiteliales, incluido el trabajo sobre la vía de P2X7.
• Modelos de heridas y epiteliales — sistemas ex vivo de piel humana y de cultivo epitelial que estudian la reepitelización, siguiendo a Heilborn y colegas.
• Modelos de angiogénesis — ensayos en células endoteliales de la formación de vasos mediada por FPRL1, tal como se resume en las revisiones de Dürr y Vandamme.
• Investigación de fragmentos y análogos — derivados de LL-37 truncados y modificados utilizados para cartografiar qué regiones de la secuencia de 37 residuos portan la actividad sobre membranas frente a la actividad sobre receptores.

Notas analíticas y de calidad

LL-37 es un péptido sintético más grande y complejo que los heptapéptidos de otras partes de esta serie, y su control de calidad merece una atención proporcionalmente mayor. La identidad debe confirmarse por espectrometría de masas frente a la masa esperada de aproximadamente 4,493.3 Da para la secuencia completa de 37 residuos. Las secuencias truncadas son el modo de fallo característico en la síntesis de péptidos largos, y varios fragmentos de LL-37 son en sí mismos biológicamente activos en los trabajos publicados, de modo que una preparación contaminada con fragmentos no es simplemente impura: es un sistema experimental diferente. La HPLC de fase inversa debe mostrar un único pico dominante, y los investigadores que trabajan en ensayos de receptores en particular deben confirmar que el material es el péptido de longitud completa en lugar de una mezcla de fragmentos.

Como con cada compuesto de esta serie, el documento operativo es un certificado de análisis específico del lote que reporta la pureza por HPLC y la identidad por espectrometría de masas para el lote exacto suministrado. Nuestra guía para Leer un COA de péptido explica cómo evaluar estos documentos campo por campo.

Conclusión

LL-37 ocupa una posición única en la biología humana: la única catelicidina humana, liberada de hCAP18 por la proteinasa 3 en los sitios de activación de neutrófilos, y documentada en el laboratorio en dos regímenes mecanicistas distintos — alteración de membranas directa y dependiente de la concentración en sistemas de ensayo antimicrobianos, y señalización mediada por receptores a través de FPRL1/FPR2, P2X7 y vías relacionadas en modelos inmunes, epiteliales y endoteliales, incluido tejido de herida humano ex vivo. Pocos péptidos ilustran con tanta claridad por qué el modelo, la concentración y las condiciones deben reportarse como parte de cualquier resultado.

Antes del uso en laboratorio, verifique que el material muestra al menos un 99% de pureza por HPLC, que su identidad está confirmada por espectrometría de masas frente a la secuencia completa de 4,493.3 Da, y que va acompañado de un certificado de análisis específico del lote que coincide con el lote suministrado. NUPEPS suministra LL-37 10MG como material de investigación con la documentación del lote disponible para su revisión, de modo que los investigadores puedan confirmar la identidad y la pureza del lote exacto en cuestión antes de diseñar experimentos en torno a él.