Guida alla ricerca su LL-37: catelicidina, immunità e uso in laboratorio

LL-37 è l'unico peptide antimicrobico catelicidina umano: un peptide alfa-elicoidale di 37 amminoacidi scisso dalla proteina precursore hCAP18, codificata dal gene CAMP . È stato identificato a metà degli anni Novanta da due gruppi di ricerca svedesi che lavoravano sui neutrofili umani, e da allora è diventato uno dei peptidi di difesa dell'ospite più studiati in laboratorio — non solo per la sua attività antimicrobica diretta in vitro, ma anche per una seconda identità, altrettanto documentata, di molecola di segnalazione che interagisce con specifici recettori della superficie cellulare.

Quella doppia identità è la chiave per leggere con precisione la letteratura su LL-37. A concentrazioni più elevate nei sistemi sperimentali, LL-37 perturba le membrane microbiche. A concentrazioni più basse nei modelli cellulari, attrae chimicamente le cellule immunitarie, modula la segnalazione infiammatoria e influenza processi come l'angiogenesi e la riepitelizzazione delle ferite attraverso vie mediate da recettori. Concentrazioni, sistemi modello e condizioni saline influenzano fortemente quale comportamento domini, ed è per questo che questa guida separa la letteratura sulle membrane dalla letteratura sui recettori e riporta ogni risultato all'interno del modello che lo ha prodotto.

Che cos'è LL-37?

LL-37 è un peptide di 37 residui che inizia con due residui di leucina — da qui il nome: LL per le leucine iniziali, 37 per la sua lunghezza. Non viene sintetizzato come molecola autonoma nel corpo. Le cellule producono invece un precursore più grande, la proteina antimicrobica cationica umana 18 (hCAP18), costituita da un dominio catelina N-terminale conservato e dalla sequenza C-terminale di LL-37. La scissione proteolitica rilascia il peptide attivo quando e dove è necessario.

• Sequenza: LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES
• Lunghezza 37 amminoacidi
• Gene: CAMP (peptide antimicrobico catelicidina)
• Precursore: hCAP18, scissa extracellulamente, principalmente dalla proteinasi 3 nei neutrofili
• Formula molecolare: C205H340N60O53
• Peso molecolare: Circa 4.493,3 g/mol
• Numero CAS: 154947-66-7
• Struttura: Alfa-elica anfipatica in ambienti di tipo membrana; carica netta positiva (cationica)

Gli esseri umani hanno esattamente una catelicidina, il che rende LL-37 un sistema di ricerca insolitamente pulito: a differenza delle specie con grandi famiglie di catelicidine, non esiste un secondo paralogo umano a confondere l'attribuzione. L'ortologo murino, CRAMP, è lo strumento corrispondente nei modelli murini, e i ricercatori dovrebbero mantenere i due distinti quando confrontano studi tra specie.

Scoperta e processamento: da hCAP18 a LL-37

La catelicidina umana è stata identificata nel 1995, quando Agerberth e colleghi hanno clonato un cDNA del midollo osseo che codificava un precursore di tipo catelina di 170 amminoacidi e il suo peptide C-terminale predetto, FALL-39 — un peptide di 39 residui, privo di cisteina, la cui forma sintetica ha mostrato attività contro batteri di prova in vitro, con il gene espresso principalmente nel midollo osseo e nel testicolo. Lavori successivi sul processamento hanno stabilito che il peptide maturo recuperato dai neutrofili umani è LL-37 di 37 residui, scisso da quello stesso precursore, hCAP18:

Citazione: Agerberth B, et al. "FALL-39, un putativo peptide antibiotico umano, è privo di cisteina ed è espresso nel midollo osseo e nel testicolo." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1995. [PubMed PMID: 7529412]

I primi lavori strutturali hanno poi spiegato un comportamento che attraversa tutta la letteratura su LL-37: Johansson e colleghi hanno mostrato che LL-37 è disordinato in acqua e adotta la sua conformazione alfa-elicoidale in presenza di anioni e mediante oligomerizzazione, e che questa elicità si correla con l'attività antibatterica in vitro — la struttura del peptide, e quindi la sua attività, dipende dal suo ambiente:

Citazione: Johansson J, et al. "Attività antibatterica dipendente dalla conformazione del peptide umano naturale LL-37." Journal of Biological Chemistry. 1998. [PubMed PMID: 9452503]

Come il precursore diventa il peptide è stato chiarito da Sørensen e colleghi, che hanno mostrato che hCAP18 viene processato extracellulamente dopo l'esocitosi dei neutrofili: la proteinasi 3, rilasciata dallo stesso sistema di granuli, è stata la sola responsabile della scissione tra le proteasi dei granuli azzurrofili testate. Quella tempistica extracellulare conta sperimentalmente — significa che LL-37 compare nei siti di attivazione dei neutrofili piuttosto che circolare come peptide libero in condizioni di riposo:

Citazione: Sørensen OE, et al. "La catelicidina umana, hCAP-18, viene processata al peptide antimicrobico LL-37 mediante scissione extracellulare con proteinasi 3." Blood. 2001. [PubMed PMID: 11389039]

Meccanismo 1: interazione con le membrane e attività antimicrobica diretta

La sequenza di LL-37 si ripiega in un'alfa-elica anfipatica: una faccia è ricca di residui carichi positivamente (arginina e lisina), l'altra di residui idrofobici. Quell'architettura spiega il suo comportamento con le membrane. La faccia cationica è attratta dalle superfici di membrana microbica cariche negativamente; la faccia idrofobica si inserisce poi nel doppio strato lipidico, perturbando l'integrità della membrana nei sistemi modello. Gli studi biofisici su membrane artificiali e i saggi microbiologici contro un'ampia gamma di batteri — e, in lavori in vitro pubblicati, certi funghi e virus con involucro — formano il nucleo di questa letteratura.

Due cautele sperimentali la attraversano. Primo, l'attività antimicrobica di LL-37 in vitro è fortemente dipendente dal sale e dal mezzo: le concentrazioni fisiologiche di sale riducono l'attività contro diversi organismi rispetto a condizioni di saggio a basso sale, per cui le condizioni del saggio sono parte di qualsiasi risultato. Secondo, l'attività in una piastra di coltura è una proprietà del sistema peptide–membrana in quelle condizioni; non è, di per sé, un'evidenza sul ruolo del peptide in un organismo intero, dove intervengono proteine di legame, proteasi e compartimentazione. La revisione standard di questa prima identità, e della biologia del peptide in generale, resta quella di Dürr e colleghi:

Citazione: Dürr UH, Sudheendra US, Ramamoorthy A. "LL-37, the Only Human Member of the Cathelicidin Family of Antimicrobial Peptides." Biochimica et Biophysica Acta. 2006. [PubMed PMID: 16716248]

Meccanismo 2: immunomodulazione mediata da recettori

La seconda letteratura su LL-37 è iniziata quando i ricercatori hanno riscontrato effetti a concentrazioni ben al di sotto di quelle necessarie per la perturbazione delle membrane — effetti con la firma della segnalazione recettoriale piuttosto che di un'azione di tipo detergente. Il risultato di riferimento è stata la chemioattrazione: De Yang e colleghi hanno mostrato che LL-37 attrae chimicamente neutrofili, monociti e cellule T umane attraverso il recettore 1 simile al recettore dei peptidi formilati (FPRL1, ora denominato anche FPR2), un recettore accoppiato a proteine G definito:

Citazione: De Yang, et al. "LL-37, la catelicidina derivata dai granuli dei neutrofili e dalle cellule epiteliali, utilizza il recettore 1 simile al recettore dei peptidi formilati (FPRL1) come recettore per attrarre chimicamente neutrofili, monociti e cellule T del sangue periferico umano." Journal of Experimental Medicine. 2000. [PubMed PMID: 11015447]

Lavori successivi di biologia cellulare hanno aggiunto ulteriori sistemi recettoriali, incluse interazioni con P2X7 in monociti e macrofagi e la transattivazione del recettore del fattore di crescita epidermico in sistemi epiteliali, accanto a una modulazione riportata della segnalazione dei recettori Toll-like e della produzione di citochine in colture di cellule immunitarie. Vandamme e colleghi hanno esaminato questa letteratura recettoriale in modo esaustivo, e la loro sintesi coglie l'inquadramento consensuale del campo: LL-37 è un peptide di difesa dell'ospite multifunzionale le cui attività immunomodulatorie si esercitano attraverso bersagli molecolari specifici, non solo attraverso le membrane:

Citazione: Vandamme D, et al. "Un riassunto esaustivo di LL-37, il peptide catelicidina umano factotum." Cellular Immunology. 2012. [PubMed PMID: 23246832]

Punti salienti della ricerca pubblicata: modelli di riparazione e vascolari

Riepitelizzazione in modelli di ferita cutanea umana

Heilborn e colleghi hanno esaminato LL-37 in ferite cutanee umane usando un modello ex vivo, e hanno riportato che il peptide era presente nell'epitelio della ferita durante la guarigione ma assente nell'epitelio delle ulcere croniche nei loro campioni, e che bloccarlo o integrarlo nel sistema modello alterava corrispondentemente la riepitelizzazione. Lo studio è un risultato in un modello di tessuto umano — più forte di un risultato in linea cellulare, e pur sempre un modello, non una sperimentazione terapeutica:

Citazione: Heilborn JD, et al. "Il peptide antimicrobico catelicidina LL-37 è coinvolto nella riepitelizzazione delle ferite cutanee umane ed è assente nell'epitelio delle ulcere croniche." Journal of Investigative Dermatology. 2003. [PubMed PMID: 12603850]

Angiogenesi in sistemi modello

La letteratura di revisione riassume anche segnalazioni secondo cui LL-37 stimola l'angiogenesi in sistemi modello in vitro e in vivo, mediata da FPRL1 espresso sulle cellule endoteliali — estendendo lo stesso recettore identificato nel lavoro sulla chemioattrazione alla biologia vascolare e sostenendo l'inquadramento delle revisioni di LL-37 come peptide con un secondo ruolo, guidato dai recettori, oltre alla sua attività antimicrobica. I ricercatori che seguono quella specifica affermazione dovrebbero farlo attraverso le fonti primarie raccolte nelle revisioni di Dürr e Vandamme citate sopra.

Insieme alla letteratura sulle membrane, questi studi definiscono il quadro di lavoro che i ricercatori usano effettivamente: un peptide, due regimi meccanicistici, con concentrazione e contesto che decidono quale regime un esperimento osserva. Quel quadro collega inoltre LL-37 a peptidi vicini dell'immunità innata studiati per la segnalazione epiteliale e infiammatoria, come l'argomento della nostra guida alla ricerca su KPVe alla più ampia rassegna della nostra guida sulla ricerca sui peptidi in immunità e antinfiammazione.

Variabili sperimentali che modellano i risultati di LL-37

LL-37 è insolitamente sensibile alle condizioni sperimentali, e le revisioni citate sopra tornano ripetutamente allo stesso insieme di variabili. I ricercatori che progettano o interpretano esperimenti con LL-37 tengono conto di almeno quattro di esse.

• Forza ionica e composizione del mezzo. L'attività antimicrobica misurata in tamponi a basso sale può cadere sostanzialmente a concentrazioni fisiologiche di sale, e i componenti del siero si legano al peptide e modificano la sua concentrazione libera effettiva. Due studi che riportano valori di potenza diversi spesso riportano condizioni di saggio diverse, piuttosto che una biologia diversa.
• Ambiente proteolitico. LL-37 è esso stesso un prodotto di proteasi, ed è anche un substrato di proteasi: in ambienti ricchi di proteasi viene ulteriormente processato in frammenti più corti, diversi dei quali mantengono l'attività sulle membrane perdendo l'attività sui recettori, o il contrario. Il profilo dei frammenti di un campione è quindi parte della sua identità.
• Regime di concentrazione. La perturbazione delle membrane e la segnalazione recettoriale occupano intervalli di concentrazione diversi nei sistemi modello. Un esperimento progettato attorno a un regime non può essere usato per confermare o confutare l'altro, e il disegno dose–risposta nei modelli cellulari dovrebbe dichiarare esplicitamente quale regime sta sondando — come questione di progettazione, non come raccomandazione d'uso.
• Manipolazione e aggregazione del peptide. Come elica anfipatica e fortemente carica, LL-37 si aggrega e si adsorbe alle superfici più facilmente dei peptidi corti non strutturati. La preparazione delle soluzioni madri, i materiali dei contenitori e la storia di congelamento–scongelamento possono tutti spostare la concentrazione effettivamente erogata a un saggio, il che è uno dei motivi per cui le revisioni del campo insistono sulla conferma analitica del materiale in mano.

Queste variabili spiegano anche un pattern ricorrente in letteratura: i risultati su LL-37 si replicano più nettamente quando gli articoli riportano le condizioni complete del saggio, e le apparenti contraddizioni tra gruppi si risolvono frequentemente in differenze di sale, siero o composizione dei frammenti una volta che i metodi vengono confrontati in dettaglio.

Applicazioni di ricerca in laboratorio

• Lavoro su saggi antimicrobici — sistemi in vitro definiti per l'attività di perturbazione delle membrane, in cui sale e composizione del mezzo sono controllati e riportati come parte del risultato.
• Biofisica delle membrane — studi su doppi strati artificiali, liposomi e spettroscopia dell'inserzione di eliche anfipatiche, usando LL-37 come peptide elicoidale cationico di riferimento.
• Chemotassi e farmacologia recettoriale — saggi di migrazione mediati da FPRL1/FPR2 in neutrofili, monociti e cellule T, seguendo il disegno sperimentale di De Yang.
• Studi di immunomodulazione — misure di segnalazione di citochine e recettori Toll-like in colture di monociti, macrofagi e cellule epiteliali, incluso il lavoro sul pathway P2X7.
• Modelli di ferita ed epiteliali — sistemi ex vivo di pelle umana e di coltura epiteliale che studiano la riepitelizzazione, seguendo Heilborn e colleghi.
• Modelli di angiogenesi — saggi su cellule endoteliali della formazione di vasi mediata da FPRL1, come riassunto nelle revisioni di Dürr e Vandamme.
• Ricerca su frammenti e analoghi — derivati di LL-37 troncati e modificati usati per mappare quali regioni della sequenza di 37 residui portano l'attività sulle membrane rispetto all'attività sui recettori.

Note analitiche e sulla qualità

LL-37 è un peptide sintetico più grande e complesso degli eptapeptidi altrove in questa serie, e il suo controllo di qualità merita un'attenzione corrispondentemente maggiore. L'identità dovrebbe essere confermata dalla spettrometria di massa rispetto alla massa attesa di circa 4.493,3 Da per l'intera sequenza di 37 residui. Le sequenze troncate sono la modalità di fallimento caratteristica nella sintesi di peptidi lunghi, e diversi frammenti di LL-37 sono essi stessi biologicamente attivi in lavori pubblicati — per cui una preparazione contaminata da frammenti non è meramente impura, è un sistema sperimentale diverso. L'HPLC in fase inversa dovrebbe mostrare un unico picco dominante, e i ricercatori che lavorano in particolare su saggi recettoriali dovrebbero confermare che il materiale è il peptide a lunghezza piena piuttosto che una miscela di frammenti.

Come per ogni composto di questa serie, il documento operativo è un certificato di analisi specifico del lotto che riporta la purezza HPLC e l'identità da spettrometria di massa per l'esatto lotto fornito. La nostra guida su Leggere un COA di peptide spiega come valutare questi documenti campo per campo.

Conclusione

LL-37 occupa una posizione unica nella biologia umana: l'unica catelicidina umana, rilasciata da hCAP18 dalla proteinasi 3 nei siti di attivazione dei neutrofili, e documentata in laboratorio in due distinti regimi meccanicistici — perturbazione diretta e dipendente dalla concentrazione delle membrane nei sistemi di saggio antimicrobico, e segnalazione mediata da recettori attraverso FPRL1/FPR2, P2X7 e vie correlate in modelli immunitari, epiteliali ed endoteliali, incluso tessuto di ferita umano ex vivo. Pochi peptidi illustrano con altrettanta chiarezza perché modello, concentrazione e condizioni debbano essere riportati come parte di qualsiasi risultato.

Prima dell'uso in laboratorio, verificate che il materiale mostri una purezza di almeno il 99% tramite HPLC, che la sua identità sia confermata dalla spettrometria di massa rispetto alla sequenza completa di 4.493,3 Da e che sia accompagnato da un certificato di analisi specifico del lotto corrispondente a quello fornito. NUPEPS fornisce LL-37 10MG come materiale di ricerca con la documentazione del lotto disponibile per la revisione, in modo che i ricercatori possano confermare l'identità e la purezza dell'esatto lotto in questione prima di progettare esperimenti intorno a esso.